摘要：本文详解肝星状细胞与肝窦内皮细胞的生物学特性及疾病应用，提供标准化培养流程，为肝病研究与药物研发提供实验支撑。

关键词：肝星状细胞、肝窦内皮细胞、肝非实质细胞、原代肝细胞培养、肝纤维化模型、药物肝毒性、人原代肝细胞、HSCs、LECs、Liver Sinusoidal Endothelial Cells、LSECs

肝非实质细胞｜肝星状细胞与肝窦内皮细胞—生物学特性、疾病应用及标准化培养指南

肝脏作为人体最大的代谢器官，其功能的正常运转依赖于肝实质细胞与肝非实质细胞（NPCs）的协同作用。其中，肝星状细胞（HepaticStellate Cells, HSCs）和肝窦内皮细胞（Liver Endothelial Cells,LECs）是肝非实质细胞中关键的两类细胞。它们不仅维持肝脏微环境的稳态，更是肝纤维化、肝硬化、肝癌等重要肝病发生发展的核心参与者。本文将系统介绍这两种细胞的生物学特性、在疾病中的作用，并重点详解其标准化培养流程与关键技术细节，为肝病机制研究和药物研发提供可靠的实验基础。

一、肝星状细胞（HSCs）：肝脏稳态与纤维化的“双面刃"

1.1 基本生物学特性

肝星状细胞，又称肝星形细胞，位于肝窦周隙（Disse间隙），即肝细胞与肝血窦内皮细胞之间的狭小空间。在正常生理状态下，HSCs处于静息期，其特征是胞质内含有大量富含维生素A（视黄醇）的脂滴，储存了体内约70~90%的维生素A。

静息期HSCs的核心功能包括：

• 代谢和贮存维生素A，维持机体维生素A平衡
  

• 合成和分泌正常细胞外基质（ECM），如IV型胶原、层粘连蛋白
  

• 分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生调控
  

• 通过胞突收缩调节肝窦血流，影响门静脉压力
  

当肝脏受到病毒感染、酒精损伤、代谢异常等刺激时，HSCs会被激活并转化为肌成纤维细胞样细胞，这是肝纤维化发生的核心步骤。激活后的HSCs失去维生素A脂滴，大量增殖、迁移，并分泌以I型、III型胶原为主的异常ECM，同时释放促炎和促纤维化因子，最终导致肝脏瘢痕组织形成。

图1.人肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）

1.2 在疾病研究中的应用

HSCs的激活是肝纤维化的始动和中心环节，因此成为肝病研究的核心靶细胞：

• 肝纤维化机制研究：探索HSCs激活的信号通路（如TGF-β/Smad、PDGF/ERK），寻找抗纤维化新靶点

• 药物筛选：构建体外HSCs激活模型，筛选能够抑制HSCs增殖、胶原合成或促进其凋亡的化合物

• 肝靶向递送研究：利用活化HSCs高表达的PDGF受体、整合素αvβ3等靶点，设计特异性药物递送系统

• 肝癌微环境研究：探究HSCs与肝癌细胞的相互作用，揭示肿瘤微环境对肝癌发生发展的影响

1.3 人原代肝星状细胞标准化培养流程

以下流程基于LifeNetHealth人原代肝星状细胞的培养方案，适用于大多数原代HSCs的体外培养。

1.3.1 细胞复苏

预热培养基至37℃，液氮中取出冻存管快速解冻（1.5-2分钟，勿浸瓶盖）。酒精消毒后将细胞悬液转移至含9mL培养基的离心管，冲洗冻存管回收残留细胞。室温500×g离心5分钟，弃上清，用预热培养基重悬沉淀。

1.3.2 细胞铺板

计数活细胞后，按5000个细胞/cm²密度接种。先加半量培养基，接种后立即晃动培养皿使细胞均匀分布，，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。

1.3.3 细胞培养维护

每3-4天更换预热的新鲜培养基，每日镜检细胞形态（静息期呈星形，激活后变梭形）。细胞融合度达85%以上时进行传代或冻存。

图2.肝星状细胞P1代ICC分析表征图（200倍）

1.3.4 细胞消化与传代

预热胰酶和培养基，弃旧液后用PBS洗2次。按0.038mL/cm²加胰酶体积，37℃消化2-5分钟，加培养基终止消化。离心后按4500-5000个细胞/cm²密度接种新培养皿。

1.3.5 细胞冻存

预冷冻存液和冻存管，收集细胞离心后调整浓度至目标浓度，分装至冻存管。经程序降温盒-80℃过夜后，转移至气相液氮中长期储存。

二、肝窦内皮细胞（LECs）：肝脏微环境的"守门人"

2.1 基本生物学特性

肝窦内皮细胞是肝脏特别有的血管内皮细胞，构成肝血窦的血管内衬。与其他组织的内皮细胞相比，LECs具有两个突出的结构特征：

• 富含窗孔结构：细胞膜上分布着大量直径约100-150nm的窗孔，允许血浆中小分子物质自由通过

• 缺乏完整的内皮下基底膜：使LECs成为哺乳动物体内渗透性最高的内皮细胞

这些独特的结构使LECs成为肝脏物质交换的关键门户，同时还具有内吞功能，能够有效清除血液中的大分子废物、病原体和衰老蛋白，被称为体内的"血液净化器"。此外，LECs还通过分泌一氧化氮（NO）等旁分泌信号，维持HSCs的静息状态，调节肝脏微循环。

图3.肝窦内皮细胞（Liver Endothelial Cells, LECs）

2.2 在疾病研究中的应用

LECs的功能异常是多种肝病发生的早期事件：

• 肝纤维化研究：LECs毛细血管化（失去窗孔、形成基底膜）是肝纤维化的早期病理改变，先于HSCs激活

• 药物肝毒性（DILI）研究：LECs是药物进入肝脏的首要屏障，其损伤常早于肝细胞，可用于预测药物的肝毒性

• 肝靶向药物递送：利用LECs表面高表达的Stabilin-2、甘露糖受体等，设计特异性靶向载体

• 非酒精性脂肪性肝病（MAFLD）研究：LECs功能障碍参与MAFLD的发生发展，影响肝脏脂质代谢和炎症反应

2.3 人原代肝窦内皮细胞标准化培养流程

以下流程基于LifeNetHealth人原代肝窦内皮细胞的培养方案。

2.3.1 细胞复苏

预热培养基，液氮冻存管37℃快速解冻至剩小块冰，酒精消毒后转入含9mL预热培养基的15mL离心管，冲洗冻存管回收残余细胞，500×g室温离心5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀。

2.3.3 细胞铺板

计数活细胞，100mm培养皿先加5mL培养基，按5000个细胞/cm²接种，轻晃使细胞均匀分布，补培养基至10mL，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。

2.3.4 细胞培养维护

1. 每2-3天更换一次培养基
   

2. 每日在倒置显微镜下观察细胞形态：正常LECs呈典型的鹅卵石样排列，细胞边界清晰
   

3. 当细胞融合度达到85%以上时，进行传代或冻存
   

2.3.5 细胞消化与传代

预热培养基和胰酶/EDTA，弃旧液，PBS洗2次，按0.05mL/cm²加胰酶（100mm皿/3mL），37℃孵育2-5分钟至细胞变圆脱落，加培养基终止消化（0.091mL/cm²，100mm皿/5mL），收集细胞后500×g离心5分钟，弃上清重悬，按4000-5000个细胞/cm²接种培养。

2.3.6 细胞冻存

冻存液和冻存管冰上预冷，按传代步骤收集细胞，两次500×g离心5分钟，冰上用预冷冻存液重悬至目标浓度，分装至冻存管，程序降温盒-80℃过夜，次日转移至气相液氮长期储存。

三、HSCs与LECs的共培养及应用前景

肝脏是一个高度复杂的器官，单一细胞培养无法模拟体内的肝脏微环境。将HSCs与LECs进行共培养，能够更好地重现肝脏的生理和病理状态：

• 构建肝纤维化体外模型：共培养体系中，LECs的毛细血管化会诱导HSCs激活，更接近体内肝纤维化的发生过程

• 药物筛选：共培养模型能够更准确地评估药物的肝毒性和抗纤维化效果

• 肝脏类器官构建：将HSCs、LECs与肝细胞、库普弗细胞共培养，构建功能完备的肝脏类器官，用于再生医学和疾病研究

LifeNetHealth可提供同一供体来源的HSCs、LECs和库普弗细胞，避免了不同供体间的个体差异，能够构建更稳定、更接近生理状态的肝脏微环境模型。

四、FAQ：肝非实质细胞常见问题

Q1：原代HSCs和LECs可以传代多少次？

A1：人原代HSCs在体外培养过程中会逐渐自发激活，一般建议传代不超过3代。超过传代次数后，细胞会发生表型改变，影响实验结果。

Q2：为什么HSCs接种后必须立即晃动培养皿？

A2：HSCs的贴壁速度非常快，如果接种后不立即晃动，细胞会集中在培养皿中央，导致细胞分布不均，影响生长和后续实验。

Q3：如何验证HSCs的激活状态？

A3：可以通过检测细胞标志物的表达来验证HSCs的激活状态。静息期HSCs高表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和脂滴相关蛋白；激活后，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原的表达明显升高，而GFAP表达降低。

Q4：如何验证LECs的纯度和功能？

A4：LECs的纯度可以通过流式细胞术检测内皮细胞标志物CD31、vWF和LECs特异性标志物LYVE-1的表达来验证。其功能可以通过检测内吞活性（如摄取乙酰化低密度脂蛋白）和窗孔结构（扫描电镜观察）来评估。

五、参考文献

[1] Schwabe RF, Brenner DA. Hepaticstellate cells: balancing homeostasis, hepatoprotection andfibrogenesis in health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2025.

[2] Chen G, et al. Endothelial RAP1A attenuates sinusoidalcapillarisation and liver fibrosis by inhibiting RAF1-mediated Notchactivation. Gut, 2026.

本文基于公开资料由LifeNetHealth中国供应商上海曼博生物整理，仅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供人肝非实质细胞（NPC）、人原代肝细胞、Kupffer细胞、肝星状细胞（HSCs）、肝窦内皮细胞（LECs）及相关肝病研究细胞产品，支持药物ADME-Tox评价、MASH/MAFLD研究、肝纤维化研究及3D肝脏模型构建等科研应用，可扫描下方图片访问上海曼博生物网站查看更多关于人原代肝细胞相关信息。