间充质干细胞质控：别再用细胞代次定义细胞真实年龄了！

摘要：间充质干细胞代次越低就越好？本文将为您深度揭秘：为什么国内外监管机构与行业专家都倡导采用群体倍增水平（PDL）作为细胞治疗和生物制品生产的主要质量控制标准。

关键词：间充质干细胞、干细胞外泌体、细胞外囊泡、间充质干细胞培养基、外泌体生产、外泌体纯化、无血清培养基、化学成分限定外泌体培养基、间充质干细胞三系分化、外泌体质量控制、3D微载体悬浮培养、外泌体表征

在细胞治疗与生物制品生产领域，我们经常会在文献或实验讨论中听到这样的话：“我们使用的是P2代的间充质干细胞，状态很好"，“这个批次我们扩增到了P5代"。

但是，您是否想过：不同实验室、不同工艺下培养出来的“P2代"细胞，它们的生理“细胞真实年龄"真的是等同的吗？如果我们告诉你，由于培养工艺的不同，某个实验室的P2代细胞，在生理活性上可能已经相当于另一个实验室的P8代细胞，甚至已经提前迈入了细胞衰老的泥潭，你会不会感到震惊？今天，我们就来聊聊为什么单纯使用细胞代次（Passage Number）是一个巨大的质控漏洞，以及为什么群体倍增水平（PDL，Population Doubling Level）才是衡量间充质干细胞体外生理寿命的“度量衡"。

一、细胞代次（Passage Number）的隐形偏差：被忽略的“排班表"与接种密度

所谓细胞代次，是指细胞在体外培养过程中被解离、稀释并分瓶转种的累计次数。它是一个离散的物理动作，却没有考虑初始接种密度、细胞收获密度以及细胞在单代中所经历的实际分裂次数。

让我们来看一组来某品牌培养基厂商发布的量化实验数据^【5】：

1. 传统接种工艺：如果以5,000 cells/cm²的密度接种，并在达到80%汇合度（约20,000 cells/cm²）时收获，细胞在这一代中发生了2次倍增；

2. 低密度接种工艺1：如果以1,250 cells/cm²密度接种，同样收获至20,000 cells/cm²，细胞需要发生4次倍增；

3. 低密度接种工艺2：如果采用超低密度（78 cells/cm²）启动接种，细胞要长满则在瓶内拼命分裂8次（即经历8次倍增）！

这意味着，同样是传代到了Passage 2，采用低密度培养出来的细胞，其体外分裂次数（16次倍增）实际上已经等同于传统工艺下Passage 8的细胞（16次倍增）！

此外，细胞培养往往要配合人类的工作日程。由于周末假期、人员请假或实验排班导致的提前收获或延迟收获，这些看似微小的工艺变动，都会在不改变细胞代次的前提下，让细胞的累积倍增数产生巨大的漂移，导致实验或生产的重现性崩溃。

二、群体倍增水平（PDL）：定义“细胞真实年龄"的科学尺度

为了消除由于接种密度和人为排班带来的系统性偏差，行业和国际监管机构一致认可：追踪并报告群体倍增水平（PDL）或累积群体倍增（CPD）才是体外定义细胞真实年龄的实践。

PDL能够记录细胞自原代分离以来，在体外实际发生的倍增次数。它的计算公式科学且严谨：

PDL=PDL₀+3.322×(log₁₀Cf-log₁₀Ci)

其中Ci代表接种时的活细胞总数，Cf代表培养结束收获时的细胞总数。

通过这个公式，无论你采用何种接种密度，无论你是在第4天还是第6天收获细胞，你都能获得一个标准化、可进行横向比对的生理年龄指标。

三、监管红线：ICH Q5D与国内外指南的硬性合规要求

在药物申报和生物制品生产的CMC（化学、制造与控制）审查中，PDL绝非可有可无的辅助数据，而是被监管机构写进红头文件的审查指标：

• ICH Q5D指导原则（《用于生物技术产品/生物制品生产的细胞基质的来源和特征鉴定》）中明确规定：“对于体外寿命有限的双倍体细胞系，在研究、开发和制造的所有阶段，准确估计群体倍增数（PDL）比较重要。"^【4】

• 行业放行指南《用于生产生物制品的细胞系鉴定要点》也指出：“用于生产的细胞，其群体倍增水平（PDL）不应超过制造商基于书面实验数据建立的可接受上限。"

这直接意味着，如果你的细胞库（MCB/WCB）没有建立完备的PDL追踪环路，你在向中国国家药监局（NMPA）或美国FDA提交细胞治疗或外泌体新药IND申报时，将面临一定的合规和退审风险。

图1. ICH Q5D指导原则《用于生物技术产品/生物制品生产的细胞基质的来源和特征鉴定》

四、深度危害：高PDL是如何让细胞“未老先衰"的？

为什么监管机构如此看重PDL？因为细胞的生理极限是不可逆的^【1】。当细胞经历过多的分裂、累积了过高的PDL后，哪怕它在显微镜下的形态还没有发生改变，一系列毁灭性的退化就已经在暗中发生：

1. 隐性转录组漂移

国际学术期刊（如WieseDM等人2019年的研究）证实，在细胞表现出明显的形态变宽、变扁等细胞衰老指征之前，大规模的转录组漂移和基因表达异常就已经提前发生。这意味着，你自以为“健康"的细胞，其分子调控网络可能已经发生了隐性漂移^【3】。

2. 三系分化潜能衰退与丢失

研究表明，随着累积PDL的增加，间充质干细胞会逐步丧失向成骨和成脂谱系定向分化的能力。LoSurdo和Bauer的研究也证明，即使经典的免疫流式表面标志物（如CD73、CD90、CD105阳性率均保持在≥95%的稳定状态），高PDL细胞的增殖速率和分化潜能也早已大幅滑坡^【2】。

3. 体内Potency断崖式下跌

临床回顾性研究指出，来自低PDL代次（如真实PDL低的Passage 1或2）的MSCs，在体内发挥的免疫抑制和抗炎效果，强于已经过多倍增的高PDL细胞。

五、行业践行：如何建立PDL控制体系？

在间充质干细胞和外泌体产业迈向工业化、标准化的今天，“细胞代次"这个模糊的指标被留在过去的实验室里。引入群体倍增水平（PDL）这一标尺，才能锁死细胞的“生理时钟"，确保临床级细胞产品的均一性、安全性和有效性，让每一批细胞治疗制剂都安全、可控。

• 出厂标定：选择每一批次间充质干细胞（MSCs），要求供应商在瓶身或分析证书（CoA）上均明确、标写了该批细胞的具体累积PDL数值，让研究者从实验开始前就对细胞的生理年龄一目了然，实现高重现性的生产控制。

• 科学的收获红线：为了确保在3D生物反应器连续生产中不触碰细胞衰老的红线，工艺建议是：对于骨髓源（BM）和脂肪源（AD）MSC，建议将终产物控制在20-22 PDL内；而对于增殖能力更旺盛的脐带源（UC）MSC，建议严格控制在30 PDL以下，以保障出色的旁分泌Potency与临床药效。

六、Solallis化学成分限定MSC扩增培养基

针对高PDL带来的细胞衰老及传统培养基需包被、成分不明确等痛点，日本Solallis Bio推出的无动物源（AOF）无血清培养基（可访问曼博生物查看），能为您关注生理时钟，为临床级量产提供合规支撑。

图2. Solallis品牌Stem Design AF化学成份限定干细胞培养基

1.🛡️细胞抗衰老，大幅延展PDL科学范围

传统无血清培养基易导致细胞迅速衰老。Stem Design AF含有缓解衰老的配方；
传统血清培养基在P7代即陷入停滞，而该产品支持MSC安全、连续扩增至P14代（累积PDL≥36）。抗衰挽救：即使是在劣质培养基中已表现出宽扁老化特征的MSC，转入后仍能重新挽获旺盛的增殖活性。

2.🧬维持MSC鉴定标准与分化潜能

即便经历体外高PDL连续倍增，仍能保留MSC的金标准属性：

高纯度维持：阳性标志物（CD73、CD90、CD105）表达率均大于99%；阴性标志物（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）表达率严格低于0.3%（远优于<2%的ISCT标准）。

分化不滑坡：保留向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞定向分化的三系分化潜能。

3.🧪专为外泌体（EVs）量产优化，提供纯净背景

无外泌体背景：培养基配方不含外泌体背景成分，不干扰后续纯化产物的表征与纯度。

成分限定（CD/AOF）：无动物及人源成分，消除批次间不稳定，批次一致性好。

即用型免包被（Coating-Free）：特含促贴壁的配方，在未经包被的普通培养瓶中即可实现优异的贴壁率，大幅降低procedural耗材成本。

4.💰高倍增、零换液，制造成本直降50%

细胞倍增时间缩短至约20小时（同类竞品需30小时）。在6天培养周期中无需换液（零换液工艺），总体培养基消耗量与总体成本相比同类产品直降约50%/。

5.❄️耐受10次反复冻融，稳定性好

经冻融耐久性测试，即使经历多达10次反复冻融（-30°C至室温），培养基后续支持细胞生长的倍增时间（PDT）和活性仍无差异，方便了日常存储与配液。

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📚参考文献

1. Bonab MM, Alimoghaddam K, Talebian F, et al. (2006) Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biology. 7:14. doi: 10.1186/1471-2121-7-14

2. Lo Surdo J, & Bauer SR (2012) Quantitative approaches to detect donor and passage differences in adipogenic potential and clonogenicity in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18(11):877-889. doi: 10.1089/ten.tec.2011.0713

3. Wiese DM, Wood J, & Shaffer AM, et al. (2019) Accumulating Transcriptome Drift Precedes Cell Aging in Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 8(9):945-958. doi: 10.1002/sctm.18-0260

4. International Conference on Harmonisation (ICH) Q5D Guideline Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products. FDA Official Guidance

5. Olsen TR, Ng KS, Lock LT, Ahsan T, & Rowley JA (2018) Peak MSC - Are We There Yet? Frontiers in Medicine (Lausanne). 5:178. doi: 10.3389/fmed.2018.00178

本文基于Solallis Bio公开资料及相关研究文献由其中国提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、实验参考等。上海曼博生物可提供Solallis Stem Design AF化学成分限定MSC扩增培养基、国产化cGMP M101-AF-500培养基及间充质干细胞扩增、外泌体生产、MSC-EVs一体化生产相关产品。